IND级别细胞制剂工艺开发和生产

3. 细胞制剂工艺开发

本阶段的目标是开发适合客户细胞制剂的工艺。以细胞密度、活率、记忆型CAR-T、CAR拷贝数、PH值、渗透压、杀伤效率、细胞因子释放等检测结果用来评估优化的结果。


3.1 T分选磁珠选择及比例研究

确定筛选T细胞分选磁珠,及研究分选磁珠比例,根据分选效率、细胞表型以及增殖曲线进行评估。

1.1.1使用单采血或者外周血通过密度梯度离心分离得到PBMC,PBMC分离前后会进行细胞密度、活率及记忆型CAR-T的测定,用来评估该步骤的细胞回收率以及对活率的影响。

1.1.2分离后的PBMC,进行不同磁珠及不同磁珠比例用量比例、孵育条件的分选研究,分选后的细胞进行细胞密度、活率、细胞表型检测,评估分选的回收率和纯度。

1.1.3本研究进行三批次不同供者进行测试对比,优化磁珠分选参数,为开展下一步工艺开发锁定参数。

本步骤需要客户告知初始单采血的体积、细胞数量或者外周血体积。


3.2 T细胞激活方式研究

3.2.1用客户指定的方式进行激活,研究激活成分的用量及激活时间,在不同激活时间后进行慢病毒转导,转导后进行继续培养4天后测定细胞密度、活率和记忆型CAR-T。

3.2.2本研究进行三批次不同供者进行测试对比,优化T细胞激活方式及激活时间,为开展下一步工艺开发锁定参数。

本步骤需要客户告知激活方式。


3.3 优化T细胞接种和培养密度

3.3.1研究T细胞不同的接种密度和各阶段不同的培养密度,根据细胞增殖曲线、细胞活率及细胞记忆型CAR-T进行评估。

3.3.2本研究进行三批次不同供者进行测试对比。


3.4 培养基筛选

3.4.1对比不同商品化培养基、不同商品化营养添加成分、不同细胞因子释放组成的不同完全培养基对激活后T细胞体外扩增及细胞记忆型CAR-T的影响。用不同完全培养基培养激活的T细胞,培养过程中每两天取样检测细胞密度、活率,绘制增殖曲线。D5及收获当天检测记忆型CAR-T。

3.4.2本研究进行三批次不同供者进行测试对比。


3.5 优化病毒转导方式

3.5.1使用新鲜的PBMC和上述步骤确定的工艺和完全培养基,在确定的T细胞激活时间后测试不同的转导方式,转导后每2天检测细胞密度和活率,转导4天后,取样检测细胞密度、活率、转导效率、CAR拷贝数。

3.5.1本研究进行三批次不同供者进行测试对比。


3.6 不同MOI条件下转导效率对比测试

3.6.1使用新鲜的PBMC和上述步骤确定的工艺,在转导时MOI选择6个梯度,转导后每2天检测细胞密度和活率,转导4天后,取样检测细胞密度、活率、转导效率、CAR拷贝数。

3.5.1本研究进行三批次不同供者进行测试对比。


3.7 冻存密度研究

3.7.1使用新鲜的PBMC和上述步骤确定的工艺,进行三次完整的细胞生产,在收获当天,对细胞原液进行收获、清洗后,用远泰自主的细胞冷冻保护剂PCP001对细胞进行重悬,配制成不同冻存密度的半成品,并进行细胞密度、活率、记忆型CAR-T、CAR拷贝数、PH值、渗透压、杀伤效率、细胞因子释放的检测;然后进行包装、程序降温;程序降温后的成品再采用客户指定方式复苏进行细胞密度、活率、记忆型CAR-T、PH值、渗透压、杀伤效率、细胞因子释放的检测。

3.7.2本研究采用三批次不同供者进行测试对比,同一供者同一密度平行冻存三份。


3.8 细胞全长工艺确认

3.8.1使用新鲜的PBMC和上述步骤确定的工艺,进行三次完整的细胞生产,并进行细胞密度、活率、记忆型CAR-T、CAR拷贝数、PH值、渗透压、杀伤效率、细胞因子释放的检测。

3.8.2本研究采用三批次细胞生产进行测试对比。


3.9 单采血/外周血稳定性

3.9.1使用上述所有步骤确定的工艺,进行三个供者单采血和单个供者外周血不同方式不同供者的采集,进行每种采血方式三个制备时间点的十八批次完整的细胞生产,并进行细胞密度、活率、记忆型CAR-T、CAR拷贝数、PH值、渗透压、杀伤效率、细胞因子释放的检测对比,研究单采血/外周血稳定性。

 


预计可交付结果

细胞制剂工艺开发方案和报告;

 


3.10 细胞分析方法开发、确认和验证

远泰生物拥有具备细胞制剂分析检测的开发能力,并已建立以下细胞制剂的检测方法,可根据客户的实际需要对分析方法进行验证。


检测项目

方法

外观

目视法

PH

电位法

渗透压

冰点下降法

细胞计数

荧光细胞计数法、台盼蓝染色计数、流式细胞术等

无菌检测

直接培养法、薄膜过滤法、Bact/Alert无菌快检法等

内毒素检测

动态显色法、凝胶法

支原体检测

荧光PCR、培养法、DNA染色法

记忆型CAR-T/其他细胞表型检测

流式细胞法

CAR拷贝数检测

PCR法

杀伤活性检测

RTCA法、LDH释放、Calcein-AM、细胞计数、流式法等

细胞生物学活性机制评价

细胞因子释放法

RCL

PCR法